观察自来水中的微生物（从水源到自来水过程中处理对微生物组和抗生素耐药基因组的影响）

编译：微科盟王埃文，编辑：微科盟居居、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读

抗生素耐药基因(ARGs)是存在健康风险的新兴环境污染物。饮用水供应系统(DWSSs)，包括从水源到自来水的整个过程，在ARGs的传播和扩散中起着至关重要的作用。然而，对DWSSs中ARGs的相对丰度、多样性、迁移性和致病宿主的了解较少。因此，本研究阐明了处理和分配对三个地理区域(黄河下游、长江下游和珠江下游)微生物群落和ARGs的影响。处理过程降低了微生物群落网络的复杂性，而运输过程则增加了网络的复杂性。微生物群落和抗生素耐药基因组的组装机制主要由随机过程驱动。分配过程显著增加了随联通大流量卡机过程的贡献。经宏基因组组装鉴定，多药类ARGs(adeJ)和杆菌肽类ARGs(bacA)是饮用水中主要的可移动ARGs。木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)和琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)携带多种多药类ARGs和可移动遗传元件(MGEs)(重组酶、整合酶和转座酶)，被认为是潜在病原菌，在消毒水中含量丰富。pH、氯、纬度、经度和温度等环境因子通过直接调节MGEs和微生物群落多样性来影响ARG的丰度。本研究提供了关于饮用水中ARGs的归趋、迁移性、宿主致病性和驱动联通大流量卡因素的关键信息，有助于ARG风险评估和管理，为消费者提供高质量的饮用水。

论文ID

原名：Effects of treatments and distribution on microbiome and antibiotic resistome from source to tap water in three Chinese geographical regions based on metagenome assembly

译名：基于宏基因组组装揭示了三个地理区域从水源到自来水过程中处理和分配对微生物组和抗生素耐药基因组的影响

期刊：Water Research

IF：12.8

发表时间：2023.11联通大流量卡

通讯作者：孙文俊，谢曙光

通讯作者单位：清华大学环境学院；北京大学环境科学与工程学院

DOI号：10.1016/j.watres.2023.120894

实验设计

结果与讨论

1.DWSSs中微生物群落、病原菌和网络分析

变形菌门(平均比例为83.8%)是DWSSs中最丰富的细菌门，其次是放线菌门(8.2%)、拟杆菌门(2.8%)、Deinococcus-Thermus(2.2%)和厚壁菌门(1.8%)(图S3a)。消毒后，变形菌门和Deinococcus-Thermus的相对丰度显著增加。然而，消毒后拟杆菌门和放线菌门的相对丰度下降(图S3b)。Brevundimonas、Hydrogenophaga、联通大流量卡Caulobacter经处理后显著富集(Wilcoxon检验，p＜0.05，图1a和S4)，表明这些微生物能够耐受氯。此外，DWDS水体中Achromobacter、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、Caulobacter和根瘤菌(Rhizobium)的丰度高于水源水样(Wilcoxon检验，p＜0.05，图S4)，表明这些分类群在DWDS中具有耐受氯和再生的能力。在氯化饮用水中检出了Achromobacter，其氯化后的损伤细胞具有自我修复和复苏功能，导致其在DWDSs中再生。相反，相较于水源水样，DWDS水体中的Chryseobacterium和假单胞菌(Pseudomonas)联通大流量卡丰度较低(Wilcoxon检验，p＜0.05，图S4)。有趣的是，Pseudomonas通常耐受氯，其在DWDS中的下降与以往的研究相反。处理后有机物的减少可能是其下降的原因之一。

图1. 6个DWSSs中前20个属(a)和潜在病原菌(b)。基于Bray-Curtis距离的氯化DWDS水体微生物群落相似性的距离衰减特征(c)。

主要的潜在病原菌因分区和处理方法而异。JN、DY、DG消毒后的样品中主要检出了琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)(图1b)。约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)主要在ZF子区域的消毒水中检出。DG子区域消毒水样中的主要病原菌为木联通大流量卡糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)。据我们所知，这是首次基于宏基因组测序揭示不同地理区域从水源到自来水病原菌组成变化的研究。A. johnsonii、A. junii和A. xylosoxidans是DWDSs中的主要病原菌，并且具有高度的位点依赖性，这与先前的研究结果一致。

除JN子区域外，与其他位点的水样相比，所有DWSSs的水源样品中含有最独特的菌属(图S5)。根据LefSe，Novosphingobium(细菌)、Chenonavirus(病毒)和Sphingorhabdus(细菌)是CJ中最具代表性的菌属(图S6a)。此外，Wphvirus(病毒)和联通大流量卡Caulobacter(细菌)分别是水源水样和出厂水样中的特有菌属(图S6b)。CJ区域微生物群的Shannon多样性指数高于HH区域微生物群(p<0.05)(图S7)。出厂水样(p<0.01)和DWDS水样(p<0.001)微生物群的Chao1丰富度估计值低于水源微生物群(图S7)。主坐标分析结果表明，处理和运输过程显著改变了微生物群落结构(PERMANOVA，R2=0.146，p=0.005)(图S8a)。水源的地理位置也显著影响了微生物群落结构(PERMANOVA，R2=0.234，p=0.001)(图S8b)。过滤和消毒导致特定微生物群的选择；因此，处理降低了α多样性并改变了微生物群落联通大流量卡结构，这与先前的研究结果一致。此外，基于Bray-Curtis距离发现DWDS水样微生物群落的相似性随着采样点之间距离的增加而降低(r=−0.212，p=0.009，图1c)，表明水源的地理位置对DWDS中的微生物群落有显著影响。

微生物群落网络受到处理、运输和地理位置的影响(图2)。处理过程显著减少了网络中节点和边的数量以及正相关比例(表1)，表明网络变得更简单，细菌之间的互作减少。平均路径长度越长，表明处理后能量和物质的交换越慢。相反，在运输过程中，网络变得更加复杂，与出厂水样品相比，节点和边的数量更多，表明当氯衰减时，DWDS中的微生物再生。正相关比例越高，表明水体中微生物群之间的互作程度联通大流量卡越高。较低的平均路径长度反映了DWDS中微生物之间更快的能量和物质交换。从地理区域的角度来看，微生物网络也有所不同。随着纬度的降低，正相关比例增加，平均路径长度减小，表明细菌之间的互作更多，物质交换更快。饮用水微生物的相互作用可能受到群体感应、“同类相食”机制、有机物相互利用或生物膜形成等途径的影响。例如，芽孢杆菌(Bacillus)可以产生多肽毒素杀死革兰氏阳性菌，并进一步利用死亡细胞作为营养物质。

图2. 6个DWSSs中从水源到自来水的微生物群落网络(|ρ|>0.6，p<0.05)。

表1.不同区域的微生物群落网络拓扑参数。

2.DWSSs中抗生素耐药基因组和持久性ARGs的出现和归趋

多药类A联通大流量卡RGs(占总ARGs的49.71%)是主要的ARGs，其次是杆菌肽类(16.63%)、大环内酯-林可酰胺-链阳菌素类(5.05%)和β-内酰胺类ARGs(4.62%)(图S9a)。总ARG相对丰度范围为0.11~1.61 copies/cell，并且处理后ARGs的富集主要源于多药类ARG相对丰度的增加(除ZH子区域外)(图3a)。rosB对膦胺霉素具有耐药性，经处理后其含量增加了50%以上(图3b)。在饮用水和土壤中，抗生素和消毒剂可以通过相同的耐药机制(例如，多药外排泵)在微生物种群中诱导交叉耐药性和共耐药性。此外，氯消毒会导致消毒剂耐药微生物和抗生素耐药微生物的选择(例如假单胞菌(Pse联通大流量卡udomonas))，这有助于ARGs的传播。此外，生物/颗粒碳过滤可导致过滤出水中ARGs的富集，过滤材料被认为是ARGs的储存库。这些处理(过滤和消毒)产生的选择效应解释了出厂水中ARG丰度的增加。

总ARGs的相对丰度在运输后显著下降(p<0.01，图S9b)。例如，氨基糖苷类、β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类和万古霉素类ARGs的相对丰度在运输后降低了50%以上(图S10)。编码多药耐药的某些亚型(如emrA、mdtK、mexE、mexW、TolC、multidrug_ABC_transporter)和对大环内酯-林可酰胺-链阳菌素产生耐药性的macA的相对丰度在运输后降低了50%以上(联通大流量卡图3b)。与出厂水样相比，分配过程显著降低了ARGs的相对丰度，这与之前报道的结果相反。由于氯的衰减，细菌的再生有助于微生物群落多样性的增加，从而降低了抗生素耐药菌的比例，导致ARGs的相对丰度下降。

除JN和ZF子区域的样品外，水源水样中具有最独特的ARG亚型(图S11)。从水源至自来水中存在36种持久性ARG亚型(占总ARG的46.4%~92.0%)。其中bacA(4~46%)、multidrug_transporter(3~12%)和sul1(1~52%)是占优势的核心ARGs(图3c)。从水源到自来水，多药类ARGs和杆菌肽类ARGs在DWSS中占主导地位，并且在处理后丰度增加，这与饮用联通大流量卡水的其他研究结果一致。据报道，含有多药类和杆菌肽类ARGs的微生物通过外排泵或改进的细胞结构抵抗毒素和消毒剂的选择压力。这有助于过滤和消毒后微生物的存活和增殖，解释了处理后ARGs富集的原因。具体而言，持久性ARGs的相对丰度与总ARGs的相对丰度呈正相关(r=0.943，p=7.5E-9，图S12)。

ARGs的多样性因地理区域而异(图S13)。值得注意的是，ZJ区域抗生素耐药基因组的Chao1丰富度值显著高于CJ区域(p<0.01)。此外，HH区域(p<0.01)和ZJ区域(p<0.05)抗生素耐药基因组的Shannon多样性指数均高于CJ区域。水源地理位置显著影响饮用水的抗生素耐药基因组(联通大流量卡PERMANOVA, R2=0.122，p=0.023，图S14)。地理位置可以通过改变微生物群落或水源的抗生素耐药基因组来影响饮用水中的抗生素耐药基因组。

图3. (a)6个DWSS中ARG类型的相对丰度；(b)处理或分配后主要ARG亚型的去除或富集率；(c)样品中持久性ARG亚型的组成。

3.DWSSs中微生物群落和抗生素耐药基因组的组装机制

NCM显示，微生物群落组装主要由随机过程决定(R2>0.8)(图4a)。通常，R2值越高表明随机性越强。因此，随机过程对DWDS水体微生物群落组成的影响(R2=0.943)大于对水源水样(R2=0.851)和出厂水样(R2=0.863)微生物群落组成的影响联通大流量卡。Thom等人通过Meta分析也发现，水源水样和自来水的随机性都很高，尤其是自来水。水源水或处理的确定性影响随着与DWTP距离的增加而减小，导致DWDS散装水中微生物群落的随机性增加，这表明来自处理的选择性压力可能在DWDS中消退。DWDS的随机性增加可能归因于以下因素：遗传漂变、处理和水源的影响以及水力条件。此外，DWSS的地理位置影响了迁移率和微生物群落组装。HH区域微生物群落的迁移率(m=0.43)和随机性(R2=0.914)均高于其他两个区域。

抗生素耐药基因组的组装主要由随机过程主导(R2>0.4)(图4b)。CJ区域抗生素耐药基因组组装的随机性高于其他两个区域(R2=0.694)。此联通大流量卡外，从水源到自来水过程中，随机性对抗生素耐药基因组组装的重要性增加(水源水R2=0.494，出厂水R2=0.556，DWDS水R2=0.748)，对应于微生物群落组装的结果。以往对黄河地区水源和自来水的研究表明，抗生素耐药基因组组装机制受随机过程调节。

图4.基于NCM的6个DWSS中微生物群落(a)和抗生素耐药基因组(b)的组装机制。R2：NCM系数，m：微生物群或ARGs的迁移率。

4.DWSSs中与ARGs共存的MGEs和致病性ARG宿主

基于宏基因组组装发现，除JN和ZH子区域外，与ARGs共发生的MGEs在消毒后富集(图5a)。由于细胞膜通透性增强和较强的氧化应激反应，氯化促进了质粒的水平联通大流量卡转移。在DG子区域，整合酶和MGEs对消毒后ARG水平基因转移有很大影响。与MGEs共存的ARGs(即可移动ARGs)由多药类(相对丰度，占可移动ARGs的33.5%)、杆菌肽类(21.9%)、磺胺类(14.6%)和氯霉素(12.5%)ARGs组成(图5b)。bacA(21.9%)、sul1(11.4%)、氯霉素乙酰转移酶(cat)(8.4%)、多药转运蛋白(4.3%)、adeJ(4.4%)和catB(4.1%)是与MGEs共存的主要ARG亚型，具有相对较强的水平转移潜力。

基于组装contigs，食酸菌属(Acidovorax)、不动杆菌属(Acinetobacter)、甲基杆菌属(Methy联通大流量卡lobacterium)、甲基营养菌属(Methyloversatilis)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)被鉴定为消毒水中ARG的宿主，这与它们对消毒剂有很强的抗性有关(图S15)。此外，作者还尝试了bin分析来进一步证明本研究的结果。基于bin分析的结果与基于contigs分析的结果相似。例如，携带ARG的bin.10(JN)被鉴定为琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)，在JNG3位点有较高的丰度(图S16和表S5)，与基于contig水平的结果一致(图6a)。然而，在DWDS水样联通大流量卡中偶尔也能检测到其他ARG宿主(如Curvibacter、Dechloromonas、Pseudomonas、Stenotrophomonas和Sphingomonas)，这表明它们可能存在于DWDS生物膜中。有研究表明，Pseudomonas是DWDS生物膜上的第一个定殖菌并携带多种ARGs(mexT、mexW、aph(3′)-I和aph(2′)-I)，导致ARGs在饮用水中增殖和传播。当水力条件改变或在DWDS中添加消毒剂时，这些存在于生物膜中的ARG宿主会从管道中分离出来，导致它们在DWDS散装水中偶尔出现。

饮用水风险评估广泛需要有关ARG移动性和宿主致病性的信息。在JN、DY、ZF和D联通大流量卡G子区域的消毒水中广泛检测到乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)和琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)，且其相对丰度较高(图6a、b和表S5)。作为潜在的病原菌，它们主要携带多药类ARGs(如adeJ、mdfA、mdtK、mexT、oprM和TolC)和MGEs(包括重组酶和转座酶)(图6c)。据报道，医院废水的氯化处理在去除多药耐药病原体(如Acinetobacter junii)方面效率低下，这与本研究结果一致。先前的一项研究表明，病原菌比非致病菌更容易传播ARGs。此外，Mycobacterium gordonae和产碱假单胞菌(Ps联通大流量卡eudomonas alcaligenes)具有氨基糖苷类、喹诺酮类和多药耐药类ARGs，它们主要在CJ区域的DWDS水样中被检出。一项对自来水的大规模调查显示，M. gordonae和P. alcaligenes分别携带aac(2′)-I和mexW。因此，饮用水系统中存在多种ARGs并表现出地理差异。

图5. (a)6个DWSSs中与ARGs共存的MGEs的组成和丰度；(b)基于宏基因组组装，ARG类型和亚型与MGEs共存的百分比。

图6. (a)6个DWSSs中致病性ARG宿主的相对丰度和组成以及宿主携带的ARG类型；(b)基于宏基因组组装的致病性ARG宿主及其携带的ARG亚型的百分比；(c)联通大流量卡消毒水中潜在病原菌携带的ARGs和MGEs的共现模式。

5.DWSSs中ARGs与生物/非生物因素的关系

VPA显示，仅病原微生物种群就占抗生素耐药基因组总变异的19.8%(图7a)。MGEs和病原微生物种群合计占抗生素耐药基因组改变的13.1%。Procrustes分析显示，微生物群落的分布与抗生素耐药基因组相似(M2=0.686，p=0.002)(图S17a)，而与ARGs共存的MGEs的分布与抗生素耐药基因组的分布不一致(M2=0.905，p=0.147)(图S17b)。同样，相比于与ARG共存的MGEs的相关性(r=0.272，p=0.146)(图S18b)，ARG的相对丰度与ARG宿主的联通大流量卡相对丰度显著相关(r=0.794，p=1.3×10−6)(图S18a)。RDA显示根瘤菌(Rhizobium)和不动杆菌(Acinetobacter)是决定抗生素耐药基因组组成的核心微生物属(图S19)。Acinetobacter普遍存在于消毒水中。各种寡营养水生生态系统(例如，饮用水河流-水库系统、湖泊和饮用水系统)中的抗生素耐药基因组变化更可能与其固有的微生物和分子机制有关。微生物群落和MGEs被认为是通过垂直和水平传播途径调节饮用水系统中抗生素耐药基因组的主要生物因素。然而，它们对抗生素耐药基因组的相对贡献仍然存在争议。在本研究中，基于VPA、Procrustes和Spearman相关分联通大流量卡析，ARGs与微生物群落或ARG宿主的相关性高于与与ARGs共存的MGEs的相关性。

除了生物因素(微生物群落和MGEs)外，非生物因素也影响ARGs。ARGs的总相对丰度与pH呈负相关(r=-0.492，p=0.006)(图S20a)。pH通过质子动力机制调节土壤中的抗生素耐药基因组，驱动多药外排泵，特别是通过影响外排泵基因，包括mdtABC-tolC、mexEF-oprN和macAB-tolC。余氯和总氯与ARGs均呈正相关(r=0.58，p=0.0008；r=0.561，p=0.001)(图S20b、S20c)。以往的许多研究中均报道了氯可以影响抗生素耐药基因组。细菌对抗生素和消毒剂具有相联通大流量卡似的代谢途径或反应机制，导致饮用水或土壤中抗生素和消毒剂耐药性的共选择。酪氨酸组分(EEM.I)与ARGs呈正相关(r=0.452，p=0.01)(图S20d)。氯化后低分子量有机物如酪氨酸(EEM.I)水平的增加可能促进抗生素耐药菌的再生，因为这些有机物在寡营养DWDS中充当碳和能量来源，从而增加ARGs的相对丰度。此外，温度与ARGs(氯霉素、膦胺霉素和万古霉素)呈正相关(图7b)。SEM分析显示(图7c)，温度也通过影响微生物群落改变了ARG的相对丰度，这与之前对自来水和河流水样的研究结果一致。细菌对多种应激源(如温度和抗生素应激)的反应是相似的，并且涉及相似的途径。因此，微生物组的热适联通大流量卡应性有助于ARG的富集。地理位置(纬度和经度)也与ARGs(膦胺霉素和万古霉素)呈负相关(图7b)。

SEM全面量化了MGEs、微生物Shannon多样性、pH、总氯、纬度、经度和温度对ARGs相对丰度变化的影响(图7c)。环境因子间接影响ARGs，直接影响微生物群落和MGEs。综上所述，对DWSS中ARG相对丰度变化的标准化总影响排序如下：纬度(0.44)>微生物Shannon多样性(−0.39)>MGEs(0.37)>温度(0.33)>总氯(0.21)>经度(−0.19)>pH(−0.13)(图7d)。

图7. (a)VPA显示病原微生物种群和MGEs对抗生素耐药基因组变异的贡献；(b)ARG联通大流量卡类型的相对丰度与环境因子之间的相关性；(c)SEM展示了所选环境因子、MGEs、微生物群落多样性和ARGs之间的综合关联框架；(d)基于SEM，非生物/生物因素对总ARG相对丰度的标准化影响。

结论

本研究揭示了黄河下游、长江下游和珠江下游3个地理区域的DWSSs(从水源到自来水)中ARGs和微生物群的变化。结果表明，处理、分配和地理位置对微生物群落组成、多样性和微生物网络相互作用有显著影响。地理位置极大地改变了抗生素耐药基因组的多样性。微生物群落和抗生素耐药基因组的组装主要由随机过程决定。在消毒水中频繁检出对多种抗生素耐药并携带高丰度MGEs的潜在病原菌Achromobacter xylosox联通大流量卡idans(17.74%)、Acinetobacter junii(16.10%)和Acinetobacter calcoaceticus(10.09%)。SEM分析表明，pH、氯、纬度、经度和温度等环境因子通过调节MGEs和微生物组对ARG丰度产生间接影响。